style="width:2.30666in;height:0.6666in" /> (1) 本文是学习GB-T 18641-2018 伪狂犬病诊断方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了伪狂犬病的血清中和试验、乳胶凝集试验、伪狂犬病病毒抗体 ELISA(PrV-ELISA)、
猪伪狂犬病 gB-ELISA (阻断法)和gE-ELISA
(阻断法)等抗体检测方法及病毒分离鉴定、聚合酶链式反
应和家兔接种试验等病原检测方法。
本标准适用于猪、牛、羊、犬、猫及其他易感动物的伪狂犬病诊断、检疫、免疫抗体评估和流行病学调
查等。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
NY/T 678 猪伪狂犬病免疫酶试验方法
3 血清中和试验(采用固定病毒稀释血清法)
3.3.1 DMEM 培养液(见附录 A)。
3.3.2 0.25%胰酶(见附录 A)。
GB/T 18641—2018
3.4.1 病毒半数细胞培养物感染量(TCID₅o) 的测定
3.4.1.1 病毒培养和收获
将伪狂犬病病毒(野毒株)接种于长成单层的 PK-15
细胞，接种量为液体培养基的1/10体积，37℃
培养，待出现病变后，将细胞培养物冻融，离心去除细胞碎片，收获病毒。
3.4.1.2 病毒效价测定
3.4.1.2.1 用 DMEM
培养液将伪狂犬病病毒作连续10倍稀释，即10-¹、10-²~10- °稀释，每个病毒稀
释度取100 μL 加入96孔细胞培养板中。每个病毒稀释度接8个孔。
3.4.1.2.2 每孔加入100μL 经0 . 25%胰酶消化的 PK- 15
细胞悬液(细胞含量以10⁵个/ mL 左右为 宜)。设非接毒、加等量 DMEM
的正常细胞培养对照。
3.4.1.2.3 细胞96孔板置37℃、5% CO₂ 培养箱中培养。
3.4.1.2.4 逐日观察接毒细胞的病变，观察4 d～5d,
记录每个病毒稀释度接种细胞的细胞病变(CPE)
孔数。在观察期内，未接种病毒的细胞应无CPE。
3.4.1.3 TCIDso计算
3.4.2.1 血清灭活
将无溶血、清亮的待检血清置于56℃水浴，灭活30 min。
3.4.2.2 血清稀释
在细胞培养板孔中加入50 μL DMEM 培养液，随后在第1孔中加入待检血清50 μL
混匀后，用微
量移液器取出50 μL 加至第2孔中，混匀后再取出50 μL
加至第3孔中，依此类推，直至第10孔(将混
合液弃去50μL),
血清稀释度即为1:2、1:4、1:8～1:1024,每份待检血清稀释度作4个重复。
3.4.2.3 加入病毒
将50 μL 含200个 TCID 的病毒液加到不同稀释度的血清孔中，37℃作用1 h。
3.4.2.4 接种细胞
每孔中加入100 μLPK-15 细胞悬液(细胞含量以3×10⁵个/ mL～5×10⁵ 个/mL
左右为宜),置
37℃、5% CO₂ 培养箱中培养。
3.4.2.5 设立对照组
3.4.2.5.1 病毒对照组
每次试验均应设病毒对照。将200 TCID
病毒液作10倍、100倍、1000倍稀释。每孔加入50μL
不同稀释度的病毒液、50μLDMEM 培养液和100μLPK-15
细胞悬液。每个稀释度病毒4个重复。
3.4.2.5.2 血清对照组
用已知中和效价的阳性血清、阴性血清与相同滴度的病毒孵化后，接种 PK-15
细胞；同时设正常培 养的细胞对照。
GB/T 18641—2018
3.4.2.6 结果观察
逐日观察，记录病变和非病变的孔数，共观察4 d～5d。1000 倍稀释病毒(0.2
TCIDso) 对照组不 引起细胞病变，100倍稀释病毒(2 TCIDo)
对照组应有0～2孔细胞病变，10倍稀释病毒(20 TCIDs) 对
照组均应有细胞病变；阳性血清、阴性血清和正常细胞对照成立，待检血清对
PK-15 细胞应无毒性，测
定结果方有效，否则该试验不成立。
3.4.2.7 结果判定
按照Reed-Muench 方法(见附录
B)计算抗体效价，如血清中和效价≥1:2,可判定为伪狂犬病抗
体阳性。
10μL～50μL 微量移液器。
4.3.1 伪狂犬病病毒乳胶凝集抗原(使用前轻轻摇匀)。
4.3.2 伪狂犬病阳性和阴性血清，稀释液(见附录C)。
取等量的乳胶凝集试验抗原(约20μL)分别与阴性血清、阳性血清在洁净的玻片上混合，混合液直
径以不超过1.0cm
为宜。如阴性血清与抗原混合后不出现凝集，而阳性血清与抗原混合后出现相当于
或高于50%凝集程度，则对照试验成立。
待检血清不必经热灭活或其他方式灭活，但应清亮透明，无溶血。
将待检血清用稀释液倍比稀释后，各稀释度取15μL～20μL
与等量胶乳凝集抗原在洁净干燥的载
玻片上用牙签搅拌充分混合，混合液直径以不超过1.0 cm 为宜。静置，在1
min～3min 内观察混合液
的凝集现象。
100%凝集程度：混合液透亮，凝集颗粒聚集在液滴的边缘。
75%凝集程度：混合液透明，出现大的凝集颗粒。
GB/T 18641—2018
50%凝集程度：混合液略浑浊，凝集颗粒较细。
25%凝集程度：混合液浑浊，有少量凝集颗粒。
不凝集：待检血清与抗原混合后，呈浑浊状态，无可见凝集颗粒。
4.4.5.1
待检血清倍比稀释后，分别与抗原混合，如出现50%凝集程度，该血清判为伪狂犬病抗体阳
性，否则判为抗体阴性。以出现50%凝集程度的血清最高稀释倍数为该血清的抗体效价。
4.4.5.2 本方法检测感染或免疫后产生的早期抗体 IgM
。 当 IgM 消失后，本方法检测为阴性。此时，
可用3.4.2"血清中和试验(适用于所有动物待检血清检测)"或5.2或5.3或5.4的"酶联免疫吸附试验
检测(仅适用于猪血清)",可能出现以下3种结果：
a) 任何一种方法为阴性，判为伪狂犬病抗体阴性；
b) 任何一种方法为可疑，建议在间隔2周后再用血清中和试验或 ELISA
检测，如这两种方法均 为阴性或可疑，判为阴性；
c)
血清中和试验和酶联免疫吸附试验均为阳性或某一种方法为阳性，判为伪狂犬病病毒抗体
阳性。
本试验包含检测猪伪狂犬病病毒抗体 ELISA(PrV-ELISA)、 猪伪狂犬病病毒 gB
抗 体 ELISA(gB-
ELISA) 和猪伪狂犬病病毒 gE 抗体 ELISA(gE-ELISA) 方法。这三种 ELISA
方法均只能用于猪血清
中伪狂犬病病毒不同抗体的检测，因为其他动物检测没有正式的阴、阳性判定标准。
5.2.1.1 酶标仪。
5.2.1.2 恒温培养箱。
5.2.1.3 微量移液器。
5.2.2.1 酶标板。
5.2.2.2 移液器吸头。
5.2.2.3 实验用水(本标准所用水应符合GB/T 6682
中二级水的规格)。
5.2.3.1 抗原(纯化后灭活的伪狂犬病病毒
5.2.3.2 酶标抗体(HRP 标记兔抗猪 IgG 抗体
5.2.3.3 阴性血清。
5.2.3.4 阳性血清。
5.2.3.5 待检血清
5.2.3.6 洗涤液(配制方法见附录 C
5.2.3.7 抗原包被液(配制方法见附录 C
GB/T 18641—2018
5.2.3.8 封闭液(配制方法见附录 C
5.2.3.9 四甲基联苯胺(TMB
5.2.3.10 终止液(配制方法见附录 C
5.2.3.11 样品稀释液(配制方法见附录C
5.2.4.1 包被
用包被液将抗原稀释到工作浓度后加入酶标板孔内，每孔100μL,37℃ 作 用 1 h
后 置 4 ℃ 冰 箱
过夜。
5.2.4.2 洗涤
弃去孔内液体，用洗涤液洗3次，每次3 min, 用吸水纸拍干。
5.2.4.3 封闭
各孔中加入封闭液100μL,37℃ 作 用 1 h。 按5.2.4.2步骤洗涤。
如等效采用商品化试剂盒，可省去5.2.4.1～5.2.4.3步骤。
5.2.4.4 加入待检血清和阴性、阳性血清对照
待检血清用稀释液进行1:40倍稀释，加入抗原孔中，每孔100μL;
同时将阴性血清对照和阳性血 清对照各加入3个抗原孔中，分别标记为 A₁ 、A₂
、A₃ 和 A 、A₅ 、A₆ 孔。37℃作用1 h, 重复5.2.4.2
步骤。
5.2.4.5 加入酶标抗体
用样品稀释液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔加入100μL,37℃ 作 用 1
h,重复5.2.4.2步骤。
5.2.4.6 加入底物
每孔加入100 μLTMB 溶液，室温避光显色25 min。
5.2.4.7 终止反应
每孔加入50μL 终止液终止反应。
5.2.4.8 读取吸光度值(OD₄9o
在酶标仪上于490 nm 波长条件下，测定吸光度值。
5.2.4.9 结果判定
5.2.4.9.1 按式(1)计算血清检测值与阳性对照血清检测值之比(S/P) 值 ：
style="width:2.30666in;height:0.6666in" /> (1)
式中：
SCx— 样品 A4 ;
NCx——(A₁OD₄+A₂OD+A₃ODg)/3;
GB/T 18641—2018
PCx——(A₄OD+A₅OD+A₆OD)/3。
5.2.4.9.2 如果 S/P≥0.5, 则判为抗体阳性。
5.2.4.9.3 如果S/P\<0.5, 则判为抗体阴性。
5.3 猪伪狂犬病病毒gB-ELISA (阻断法)
5.3.1.1 酶 标 仪 。
5.3.1.2 恒温培养箱。
5.3.1.3 微量移液器。
5.3.2.1 酶标板。
5.3.2.2 移液器吸头。
5.3.2.3 实验用水(本标准所用水应符合 GB/T 6682
中二级水的规格)。
5.3.3.1 猪伪狂犬病病毒 gB 重组蛋白为抗原的 ELISA
包被板。
5.3.3.2 辣根过氧化物酶(HRP标记的抗猪伪狂犬病病毒 gB 单克隆抗体。
5.3.3.3 阴性血清。
5.3.3.4 阳性血清。
5.3.3.5 待检血清。
5.3.3.6 四甲基联苯胺(TMB
5.3.3.7 洗涤液。
5.3.3.8 终止液(配制方法见附录C
5.3.4.1 稀释待检血清
用样品稀释液将待检血清、阴性对照、阳性对照作1:1倍稀释(即100μL
血清加100μL 稀释液),
其中阴性对照、阳性对照各做2个重复，分别标记为 A₁ 、A₂ 和 B₁ 、B₂
5.3.4.2 血清孵育
将稀释血清100μL 加入抗原孔中，18℃~26℃作用1 h。
5.3.4.3 洗涤
甩掉板孔中的溶液，每孔加300 μL 洗涤液，洗涤3次。
5.3.4.4 加入酶标抗体
加入辣根过氧化物酶标记的抗猪伪狂犬病病毒 gB 单克隆抗体，室温(18℃~26
℃)作用20 min,
洗涤3次。
5.3.4.5 加入底物
每孔加入100 μL TMB底物溶液，室温避光显色15 min。
GB/T 18641—2018
5.3.4.6 终止反应
每孔加入50μL 终止液，终止反应。
5.3.4.7 读取吸光度值(OD₆50
在酶标仪上于650 nm 波长条件下测定吸光度值。
5.3.4.8 结果计算和判定
5.3.4.8.1 对照组中，阴性血清平均 OD 值减去阳性血清平均 OD
值之差大于0.30时，试验有效。
5.3.4.8.2 按式(2)计算待检血清样品 OD₅ 与阴性对照血清 OD₆5 之 比(S/N)
值 ：
style="width:1.52in;height:0.6468in" /> ………………………… (2)
式中：
SCx ——样品 ODso;
NCx——(A₁OD₅5+A₂OD5)/2。
5.3.4.8.3 当 S/N>0.70 时，判为猪伪狂犬病病毒(gB) 抗体阴性。
5.3.4.8.4 当 S/N\<0.60 时，判为猪伪狂犬病病毒(gB) 抗体阳性。
5.3.4.8.5 当 S/N 值为0.60～0.70时，判为猪伪狂犬病病毒(gB)
抗体可疑。可于9 d～14d 后再采
血，重复检测，如仍为可疑，可判为阴性。
5.4 猪伪狂犬病病毒 gE-ELISA (阻断法)
按照 NY/T 678 中 “gE-ELISA” 的操作方法进行。
5.4.1.1 酶标仪。
5.4.1.2 恒温培养箱。
5.4.1.3 微量移液器。
5.4.2.1 酶标板。
5.4.2.2 移液器吸头。
5.4.2.3 实验用水(本标准所用水应符合GB/T 6682
中二级水的规格)。
5.4.3.1 猪伪狂犬病病毒 gE 重组蛋白为抗原的 ELISA
包被板。
5.4.3.2 辣根过氧化物酶(HRP
单克降抗体。
5.4.3.3 阴性血清。
5.4.3.4 阳性血清。
5.4.3.5 待检血清。
5.4.3.6 四甲基联苯胺(TMB
5.4.3.7 洗涤液。
5.4.3.8 终止液(配制方法见附录 C
GB/T 18641—2018
5.4.4.1 稀释待检血清
用样品稀释液将待检血清、阴性血清、阳性血清作1:1倍稀释(即100μL
血清加100 μL 稀释液),
其中阴性血清、阳性血清等分别做2个重复，分别标记为 A₁ 、A₂ 和 B₁ 、B₂。
5.4.4.2 血清孵育
将稀释血清100μL 加入抗原孔中，18℃~26 ℃作用1h。
5.4.4.3 洗涤
甩掉板孔中的溶液，每孔加300 μL 洗涤液，洗涤3次。
5.4.4.4 加入酶标抗体
加入辣根过氧化物酶标记的抗猪伪狂犬病病毒 gE 单克隆抗体，室温(18℃~26
℃)作用20 min,
洗涤3次。
5.4.4.5 加入底物
每孔加入100 μLTMB 底物溶液，室温避光显色15 min。
5.4.4.6 终止反应
每孔加入50 μL 终止液终止反应。
5.4.4.7 读取吸光度值(OD₆50
在酶标仪上于650 nm 波长条件下测定吸光度值。
5.4.4.8 结果计算和判定
5.4.4.8.1 对照组中，阴性血清平均 OD 值减去阳性血清平均 OD
值之差大于0.30时，试验有效。
5.4.4.8.2 按式(3)计算待检血清样品 OD 与阴性对照血清 OD₆ 之 比(S/N) 值
：
style="width:1.50662in;height:0.6534in" /> ………………………… (3)
式中：
SCx— 样品 A₆so;
NCx--(A₁OD₆5+A₂OD₅)/2。
5.4.4.8.3 当 S/N>0.70 时，判为猪伪狂犬病病毒(gE) 抗体阴性。
5.4.4.8.4 当 S/N\<0.60 时，判为猪伪狂犬病病毒(gE) 抗体阳性。
5.4.4.8.5 当 S/N 值为0.60～0.70时，判为猪伪狂犬病病毒(gE)
抗体可疑。可于9 d～14d 后再采
血，重复检测，如仍为可疑，判为阳性。
GB/T 18641—2018
6.2.1 直径为0.45μm 滤膜的滤器。
6.3.1 DMEM 培养基和0.25%胰酶溶液(见附录 A)。
6.3.3 仓鼠肾细胞系(BHK-21) 或猪肾细胞系(PK-15) 细胞。
对死亡病畜或活体送检处死的动物，采集脑组织(应含有三叉神经节)、肺脏和扁桃体等组织，2℃~
待检组织(可等体积混样或单独处理)剪碎并匀浆后，与 DMEM
制成1:5悬剂，反复冻融3次， 10000×g 离心10 min
后，取上清液加双抗(青霉素溶液终浓度为300 IU/mL、 链霉素终浓度为
100μg/mL) 过夜或4℃处理4 h,再经孔径为0.45 μm 滤膜过滤， 一80
℃保存作为接种材料。
将病料滤液接种至已长成单层的BHK-21 细胞(或 PK-15
细胞),接种量为所加培养液量的1/10, 37℃恒温箱中吸附1
h,加入含10%犊牛血清(血清要求无支原体污染，预先经56℃水浴灭活30 min
后使用)的DMEM 培养液，置37℃、5% CO₂ 培养箱中培养，逐日观察细胞病变。
接种后36 h～72h,
如细胞出现变圆、拉网、脱落等现象，可初步判定阳性(病料中含有伪狂犬病病
毒)。如第一次接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后，按6.4.3盲传3代，如仍无细胞病变，判为
阴性(病料中无伪狂犬病病毒)。
将出现细胞病变的细胞培养物，用已知的伪狂犬病毒阳性血清做病毒中和试验鉴定病毒，用聚合酶
链式反应(第7章)或家兔感染试验(第8章)进一步鉴定。
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7.3.3 TEN 缓冲液(见附录 A)。
7.3.4 溴化乙锭(EB) (见附录 A) 或新型核酸染料(EB 替代物)。
7.4.1 伪狂犬病病毒 gD 基因检测
引物序列：上游引物 P1:5'-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3', 下游引物
P2:5'-GTCCACG
CCCCGCTTGAAGCT-3'。 扩增靶序列是伪狂犬病病毒 gD 基因434～650 nt
间的片段，扩增产物大小
217 bp。
可用于检测伪狂犬病病毒，但不能区分猪伪狂犬病基因缺失活疫苗株和野毒株。
7.4.2 伪狂犬病病毒gE 基因检测
引物序列：上游引物 P3:5'-TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTG-3', 下游引物
P4:5'-TTT
GAATTCTTACGACACGGCGTCGCA-3', 扩增靶序列是伪狂犬病病毒 gE 基因79～446 nt
间的片
段，扩增产物大小为368 bp,能区分猪伪狂犬病gE 基因缺失活疫苗株和野毒株。
对于病死或剖杀的动物，取脑组织(含三叉神经节)、扁桃体等组织；对于待检活猪，用灭菌棉签伸入
猪鼻腔中(以棉签棉花部分全部插入鼻腔为准),同一方向转动3次，获取鼻黏液，即为鼻拭子；用扁桃体
取样器采集成年种猪扁桃体；采集公猪精液(检测前需用灭菌 PBS
做10倍稀释)。4℃~8℃冷藏条件
下运输送检。
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组织病料用组织匀浆器或研钵处理后，按1:5比例用 TEN 缓冲液(见附录
A.3)充分混悬，收集于
离心管内，反复冻融3次，10000×g 离心10 min; 鼻拭子样品，则加入1 mLTEN
缓冲液涡旋10 min
后挤压棉签，混悬液10000×g 离 心 5 min, 取上清液；精液样品，先用PBS
做10倍稀释，方可用于核酸
提取。
取组织或鼻拭子样品的上清液或稀释好的精液，按 DNA 试剂盒说明书提取 DNA
模板， -20 ℃贮
存备用。
7.5.3 聚合酶链式反应(PCR) 的操作程序
7.5.3.1 扩增伪狂犬病 gD 基因
PCR 反应体系
总体积25.0μL,MIX12.5μL, 引 物P1、P2各1.0μL(10μmol/L),H₂O5.5μL,DNA
模板5.0μL。
扩增条件为：94℃预变性5 min;94℃ 30 s,65℃ 30 s,72℃ 30
s,35个循环后72℃延伸10 min。
7.5.3.2 扩增伪狂犬病 gE 基因
PCR 反应体系
总体积25.0μL,MIX 12.5μL,引 物P3、P4 各1.0μL(10μmol/L),H₂O5.5μL,DNA
模板5.0μL。
扩增条件为：94℃预变性5 min;94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30
s,35个循环后72℃延伸10 min。
7.5.4.1 将 8 μL～10μLPCR
扩增产物加入含有溴化乙锭(EB) 或新型核酸染料(作为 EB 替代物)的
1%琼脂糖凝胶的各电泳孔中(设阳性和阴性样品扩增对照孔),电泳后，在凝胶成像系统或紫外光下观
察结果。
7.5.4.2 当阳性对照和被检样品的扩增产物大小为217
bp(必要时需要测序，目的序列参见附录 D), 可
判定为伪狂犬病病毒阳性，但不能区分 gE 基因缺失疫苗毒株和野毒株。
7.5.4.3 当阳性对照和被检样品的扩增产物大小为368
bp (必要时需要测序，目的序列参见附录 D), 可
7.5.4.2 中的阳性结果，判定被
检样品为 gE 基因缺失疫苗毒株，否则，判为扩增反应失败。
本法用于疑似伪狂犬病患病动物组织检测和分离病毒的鉴定。要求在有良好隔离条件和消毒措施
的动物房实施，试验结束后要对场地和用具实施彻底消毒。
选择健康成年家兔(至少4只),经血清中和试验或胶乳凝集试验证实为伪狂犬病病毒抗体阴性。
无菌采集病猪扁桃体或患病动物脑组织(含有三叉神经节),用生理盐水或PBS
液制成20%～30%
匀浆液，反复冻融3次后10000×g 离心10 min, 取 1 mL～2mL
上清液颈部皮下接种家兔(2只);如
接种物为疑似伪狂犬病病毒的细胞培养物，则取1 mL～2mL,
同样皮下接种家兔(2只)。同时设立接
种等量生理盐水或 PBS 或培养基的对照家兔。
GB/T 18641—2018
接种后24 h～48h,
家兔在注射部位出现奇痒，表现为家兔舔(啃)咬注射局部，导致皮肤溃烂；呼吸
困难、尖叫、四肢麻痹、痉挛等症状，病程2 d～5d,
最终死亡。对照家兔无任何临床症状，健活。可初步
判定病料或细胞培养物中含有伪狂犬病病毒。
在接种后1周，病料悬液或细胞培养物接种家兔不出现任何症状，健活；同时，对照家兔无任何临床
症状，健活。可判定病料(或细胞培养物)中不含伪狂犬病病毒。
5.4.4.8 结果阳性，可判定为猪伪狂犬病野毒感染抗体阳性；当[7.5.4.2](https://7.5.4.2
狂犬病野毒病原阳性。其余各项结果为阳性，可判断为伪狂犬病病毒感染(或免疫)阳性，但无法区分是
疫苗毒株还是野毒株所致。
GB/T 18641—2018
(规范性附录)
细胞培养和 PCR 反应常用溶液配制
A.1 DMEM 培养液配制
A.1.1 量取去离子水950 mL, 置于一定的容器中。
A.1.2 将10.0 g DMEM粉剂加于15℃~30 ℃的去离子水中，边加边搅拌。
A.1.3 每1000 mL 培养液加3.7 g 碳酸氢钠(NaHCO₃)。
A.1.4 加水至1000 mL, 用 1 mol/L NaOH 或 HCl 调 pH
值至6.9～7.0,在过滤前应盖紧容器瓶塞。
A.1.5 用0.22 μm 的微孔滤膜正压过滤除菌。4℃保存备用。
A.2 0.25% 胰酶溶液配制
胰蛋白酶250.00 mg 加入100 mL Hanks液中，充分溶解后，用0.22 μm
的微孔滤膜正压过滤除
菌， -20℃保存。
A.3 TEN 缓冲液配制
依次称量下列成分，充分混合溶解，即可。
三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 8.0) 1210.00 mg(10 mmol/L)
乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8.0) 372.00 mg(1.0 mmol/L)
三蒸水 1000 mL
A.4 溴化乙锭溶液配制
溴化乙锭 1.0 g
三蒸水 100 mL
用磁力搅拌器搅拌数小时以确保其溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，室温保存。
注：溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。建议
采用EB 替代物作为本反应扩增产物的显色剂。
GB/T 18641—2018
(规范性附录)
病毒半数细胞培养感染量(TCIDso) 和血清中和抗体(NA) 的计算(按
Reed-Muench 法 )
B. 1 病毒半数细胞培养感染量(TCID₅o)
TCIDs 指在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathic
effect,CPE)所需的病毒量。
B.2 TCIDso 计算方法
B.2.1 距离比的计算
按式(B. 1) 计算距离比(D):
style="width:1.84001in;height:0.68662in" /> … … … … … … … … … …(B.1)
式中：
Cx—— 高于50%病变百分数；
Dx 低于50%病变百分数。
B.2.2 TCIDso 的计算
按式(B.2) 计算 TCIDso:
—lgTCID=Ex+Fx … … … … … … … … … …(B.2)
式中：
Ex—— 高于50%病变率所对应的最高稀释度的对数；
Fx——
距离比×(低于50%病变率所对应的最低稀释度的对数与高于50%病变率所对应的最高
稀释度的对数之差)。
B.2.3 TCIDso 计算方法示例
接种后细胞病变累计的计算方法数据演示见表B. 1。
表 B. 1 接种后细胞病变累计的计算方法数据演示
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GB/T 18641—2018
表 B. 1 (续)
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从表B. 1 可见，该病毒的 TCID 在10-⁶
(84.600)和10-7(45.400)之间，首先按式(B. 1) 计算距
离比：
style="width:3.40674in;height:0.61336in" />
将式(B. 1) 计算的距离比数值带入式(B.2) 计算 TCIDso:
- 1gTCID=-6+0.88×(- 1)=—6.88
所以：TCIDo=10-68/0. 1 mL
B.3 血清中和抗体(NA) 计算方法
B.3. 1 距离比的计算
按式(B.3) 计算距离比(D):
style="width:1.8666in;height:0.68662in" />
式中：
Cx—— 高于50%保护率的百分数；
Dx—— 低于50%保护率的百分数。
B.3.2 中和抗体的计算
按式(B.4) 计算中和抗体(NA):
-lgNA=Ex+Fx
式中：
………… …………… (B.3)
… …………………… (B.4)
Ex— 高于50%保护率所对应的最高血清稀释度的对数；
Fx——
距离比×(低于50%保护率所对应的最低稀释度的对数与高于50%保护率所对应的最高
稀释度的对数之差)。
B.3.3 血清中和抗体效价计算方法示例
接种后细胞病变累计的计算方法示例见表 B.2。
GB/T 18641—2018
表 B.2 接种后细胞病变累计的计算方法数据演示
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从表 B.2
可见，该血清的稀释度在10-1.2(83)和10-1.8(40)之间，首先按式(B.3)
计算距离比：
style="width:1.66002in;height:0.59994in" />
将按式(B.3) 计算的距离比数值按式(B.4) 计算中和抗体效价。
=-1.2+0.7×(-0.6)=-1.66
— 1.66的反对数=1/46
即1:46稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE。
GB/T 18641—2018
(规范性附录)
酶联免疫吸附试验有关溶液的配制
C.1 洗涤液
洗涤液为含0.05%吐温-20(Tween-20)pH7.4 的磷酸盐缓冲液，配制方法如下：
将下列试剂依次加至容积为1000 mL 容器中，充分溶解即成。
氯化钠 (NaCl) 8.0 g
氯化钾(KCl) 0.2 g
十二水合磷酸氢二钠(Na₂HPO₄ · 12H₂O) 2.9 g
磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 0.2 g
吐温-20(Tween-20) 0.5 mL
加蒸馏水定容至 1000 mL
C.2 抗原包被液
包被液为25 mmol/L、pH 9.6碳酸盐冲液，配制方法如下：
碳酸钠(Na₂CO₃) 1.59 g
碳酸氢钠(NaHCO₃) 2.93 g
加蒸馏水定容至 1000 mL
C.3 封闭液
在100 mL 洗涤液中加入0.1 g 牛血清白蛋白(BSA) 即可。
C.4 底物溶液
C.4.1 pH 5.0 磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液
将下列试剂依次加入1000 mL 体积的容器中，充分溶解即成。
十二水合磷酸氢二钠(Na₂HPO₄ · 12H₂O)
无水柠檬酸(C₆H₈O₇)
加蒸馏水定容至
C.4.2 0.75% H₂O₂
取30% H₂O₂1.25mL, 加入蒸馏水，使总体积达到50 mL。
C.4.3 四甲基联苯胺(TMB) 母 液
取200.00 mg TMB溶解于100 mL 无水乙醇中。 -20℃保存。
GB/T 18641—2018
C.4.4 底物溶液(临用时配制)
0.1 mol/L pH 5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液 9.5 mL
TMB 母液 0.5 mL
0.75% H₂O₂ 42 μL
此底物液对光敏感，应避免强光照射。现配现用。
C.5 终止液
终止液为2 mol/L 硫酸(H₂SO),
浓硫酸(H₂SO₄)
蒸馏水
配制方法如下：
22.2
177.8
mL
mL
C.6 样品稀释液
样品稀释液为0.1 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液，配制方法如下：
| 将下列试剂依次加至容积为1000 mL 的容器中： | |
|---|---|
| 氯化钠 (NaCl) | 8.02 g |
| 氯化钾(KCl) | 0.20 g |
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3.87 g |
| 磷酸二氢钾(KH₂PO₁) | 0.16 g |
| 加蒸馏水定容至 | 1000 mL |
混匀后，充分溶解，最后加入0.10g 叠氮钠(NaN3) 防腐(其终浓度为0.1 g/L)。
GB/T 18641—2018
(资料性附录)
伪狂犬病病毒 gD 基因和 gE 基因的 PCR
扩增序列
D.1 伪狂犬病病毒 PCR 目 的 gD 基因扩增产物
DNA 序列
CAGGAGGACGAGCTGGGGCTGCTCATGGTGGCCCCGGGGCGGTTCAACGAGGGCCAGT
ACCGGCGCCTGGTGTCCGTCGACGGCGTGAACATCCTCACCGACTTCATGGTGGCGCTCCCC
GAGGGGCAAGAGTGCCCGTTCGCCCGCGTGGACCAGCACCGCACGTACAAGTTCGGCGCGTG
CTGGAGCGACGACAGCTTCAAGCGGGGCGTGGACA
D.2 伪狂犬病病毒 PCR 目的 gE 基因扩增产物
DNA 序列
CCATGCGGCCCTTTTTGCTGCGCGCCGCGCAGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCT
CCACCGAGGCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGACGACCCCGGGCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTC
CCTCGGCCGAGGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGACGACGATGACCTCAACGGCGAC
CTCGACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTGAGGGAGGCGCCC
CCGGCCCATCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGG
CGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTCCTGCCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCG
更多内容 可以 GB-T 18641-2018 伪狂犬病诊断方法. 进一步学习